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O Ministério da Agricultura e Reforma Agrária, por intermédio da Portaria 124 de 23 de Setembro de 1991 oficializou 2 metodologias para a detecção de adição de soro de queijo ao leite:

 Método Quantitativo: Cromatografia Líquida de Alto Desempenho – Método de Filtração em Gel
Consiste na determinação do Caseinomacropeptídeo (CMP), que é liberado no soro do queijo por ação do coalho sobre a caseína do leite no processo de fabricação.
Por exigir pessoal especializado na execução da análise, equipamento sofisticado,etc, normalmente é feito em instituições de pesquisa.

Método Qualitativo:
Consiste na detecção da presença de ácido Siálico (liberado do Caseinomacropeptídeo) como um cromóforo de cor púrpura.

Diversos fatores relacionados com a matéria prima podem ser listados como contribuintes para a obtenção de eventuais resultados falso-positivos nestes métodos de análise:

O resfriamento do leite: De maneira resumida pode-se dizer que a granelização do leite, com a conseqüente necessidade do resfriamento na propriedade, se de um lado resolveu um grande problema de qualidade e perdas econômicas, de outro, ao não ser efetuado de maneira correta, propiciou o desenvolvimento de um grupo de bactérias que até então não tinha quase nenhuma importância: as bactérias psicrotróficas (capazes de se desenvolver a baixas temperaturas), e que por meio de enzimas termoresistentes tem elevada ação proteolítica/lipolítica. Estas enzimas serão liberadas em maior quantidade no leite quanto piores forem as condições de higiene na ordenha e equipamentos, quanto maior for o tempo de estocagem e se o resfriamento não for eficaz. Os efeitos das bactérias psicrotróficas e suas enzimas são sentidos principalmente na indústria de leite longa vida, na fabricação de queijos e iogurtes.
Levando em consideração que o tempo médio de armazenamento do leite hoje em dia é de 48 horas (entre a produção/armazenamento na propriedade rural, transporte, estocagem/processamento na indústria), é óbvio que a carga de psicrotróficos no leite poderá ser elevada e conseqüentemente o teor de proteases ativas também será elevado , exercendo ação semelhante à do coalho sobre a K-caseína e liberando peptídeos quase idênticos ao CMP.

A composição do leite: Existe uma variação do teor de proteína (em especial a caseína) no inverno e no verão. Da mesma forma, vacas em final de lactação (a partir do 10º mês) tendem a dar resultados falso-positivos elevados.

Leite com Mastite: Altas contagens de células somáticas (provenientes de processos infecciosos como a Mastite) podem ativar o Plasminogênio (que não tem ação proteolítica) e convertê-lo na protease natural do leite, a Plasmina ativa ( ainda na glândula mamária). Os efeitos proteolíticos sobre a K-caseína aparecem ainda no úbere. Além disso, as células somáticas contém elevado número de enzimas proteolíticas e o leite mastítico tem um teor de K-caseína superior ao do leite íntegro. 

DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DE FRAUDE DE LEITE COM SORO
Método de determinação do Ácido Siálico

Soluções e reagentes

- ác. Tricloroacético 24%
- ác. Fosfotúngstico 20%
- Etanol 95%
- ác. Sulfúrico 0,05 molar ( ou 0,1 N)
- Reagente de Erlich *

Equipamentos e vidrarias

- Centrífuga ( ideal: 3000 rpm)
- banho-maria
- estufa
- tubo de centrifugação cônico, com tampa, capacidade de 25 ml
- Béquers, erlenmeyers e pipetas
- papel filtro quantitativo, de preferência que permita uma filtragem rápida

Técnica:

- Transferir para um béquer de 250 ml., 25 ml da amostra de leite; adicionar, com agitação cuidadosa, 25 ml do Ac. Tricloroacético 24%;
- Deixar em repouso por 30 minutos e filtrar em papel filtro quantitativo para um erlenmeyer;
- Transferir 25 ml do filtrado para o tubo de centrifugação. Adicionar 1 ml do Ac. Fosfotúngstico 20%;
- Misturar bem Deixar em repouso por 10 minutos;
- Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos. Em caso de centrífugas de Gerber (1100-1200rpm), centrifugar de 15 a 20 minutos;
- Descartar o sobrenadante e dispersar o sedimento com bastão de vidro e adição de 3ml de Etanol 95%. Rinsar o bastão com mais 1 ml de etanol. Centrifugar por mais 10 minutos;
- Descartar o Etanol e secar o tubo com o sedimento em estufa a 35-40ºC por 30 minutos;
- Adicionar 3 ml de Ac. Sulfúrico 0,05 mol/l (ou 0,1 N);
- Manter o tubo tampado em banho-maria a 80ºC, por 40 minutos (rigorosamente);
- Resfriar à temperatura ambiente;
- Pipetar 2 ml do sobrenadante para um tubo de ensaio com tampa rosqueável;
- Adicionar 0,5 ml do reativo de Erlich*;
- Manter o tubo tampado em banho-maria fervente por 30 minutos;
- Resfriar em banho de gelo até temperatura ambiente;

Resultado: O desenvolvimento de cor púrpura indica a presença de soro proveniente de coagulação enzimática (adição de coalho). Leite genuíno apresenta coloração verde/amarelada ou ligeiramente rósea.

Para intensificar a cor violácea, pode-se adicionar , antes da leitura, 2ml de Acetona P.A. ao tubo e agitar.
Notas:

Não existe um padrão comparativo de cor para constatar a quantidade de soro adicionada. É uma boa prática fazer-se uma prova com leite genuíno e neste mesmo leite adicionar quantidades de soro (5, 10, 15, 20%), para em seguida proceder-se à análise. As cores encontradas podem ser reproduzidas num manual interno, para facilitar o diagnóstico do laboratorista.

PARA DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA

é necessário efetuar uma leitura em Espectrofotômetro a 565 nm e calcular a concentração de ac. Siálico mediante uma curva de calibração elaborada com soro obtido de coagulação de leite desnatado com Renina P.A.
Importante : Grandes contagens de bactérias psicrotróficas podem levar a resultados falso-positivos, devido à ação de proteases.

* Preparo do reativo de Erlich
Pesar 5 g de p-dimetilaminobenzaldeido, adicionar 45-50 ml de água destilada e transferir para um balão volumétrico de 100 ml . Completar o volume com ácido clorídrico PA. Usar em no máximo 1 dia.
OBS: Como a quantidade a ser usada por análise é pequena, aconselha-se preparar proporcionalmente ao número de análises/dia.

*Fontes: 
Revista Indústria de Laticínios Jul/Ago 2003 :
Livro Físico Química do Leite e Derivados

Métodos Analíticos – ILCT/2001

Por Joaquim Geraldo Dias – Técnico em Laticínios e Farmacêutico Bioquímico – Braslact Ltda;